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混合淋巴細(xì)胞增殖

發(fā)布時(shí)間： 2023-01-11　　點(diǎn)擊次數(shù)： 775次

簡介
混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)也稱混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC）或稱混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR），常用于器-官-移-植前的組織配型，以測定受體和供體主要組織相容性抗原（HLA 抗原）相容的程度。
材料與儀器
器材：細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、吸管等、CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)。
試劑：
① 10％FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)基 ;
② 細(xì)胞 DCs 細(xì)胞、反應(yīng)細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞。
③ 3 H-TdR 工作液

步驟
混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的基本過程可分為如下幾步：
（一）刺激細(xì)胞（DCs）的制備
A. 取健康志愿者肝素抗凝的外周血，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞
B. 以 10％ FCS-RPMI 1640 懸浮細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中，37℃、5％ CO2 培養(yǎng) 2 小時(shí)，輕輕翻過培養(yǎng)瓶，棄掉培養(yǎng)上清，將非貼壁細(xì)胞棄掉，即得貼壁的單核細(xì)胞
C. 補(bǔ)加 10％ FCS-RPMI 1640 同時(shí)加入 20 ng/ml 的 hGM-CSF，500 IU/ml 的 IL-4，培養(yǎng)至第 7 天，收集懸浮細(xì)胞，即為 DCs
D. 刺激細(xì)胞經(jīng) 25 μg/ml 的絲-裂-霉-素 C 或 2000 rad y-射線照射處理使刺激細(xì)胞失去增殖能力。
（二）反應(yīng)細(xì)胞的制備
A 取健康人外周血制備單核細(xì)胞，PBS 洗 3 次后，37℃、5％ CO2 貼壁 2 小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞，作為反應(yīng)細(xì)胞
B 以 RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1x106 個(gè)/ml。
（三）混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)
A 將刺激細(xì)胞調(diào)整濃度分別為 1x106、5x105、2x10、1x105、5x104 個(gè)/ml， 10％FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)于 96 孔培養(yǎng)板中，每濃度設(shè)立 3 孔，100μL/孔
B 將反應(yīng)細(xì)胞濃度按 1x106 個(gè)/ml 每孔分別加入上述各孔中，100μl/孔
C 同時(shí)設(shè)立刺激細(xì)胞對照組（不同濃度刺激細(xì)胞 100μl＋培養(yǎng)液 100μl）和反應(yīng)細(xì)胞對照組（反應(yīng)細(xì)胞 100μl＋培養(yǎng)液 100μl）
D 37℃，5％ CO2 培養(yǎng) 5 天后，3 H-TdR 摻入率檢測反應(yīng)細(xì)胞的增殖水平。

注意事項(xiàng)
1. 實(shí)驗(yàn)中注意無菌操作
2. 如作單向混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，則刺激細(xì)胞接受照射劑量要準(zhǔn)確，使細(xì)胞暫時(shí)存活，但失去增殖的能力。

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