材料與儀器

蛋白酶 K 培養(yǎng)的細(xì)胞 鼠尾或小鼠組織
乙醇 異丙醇 酚 氯仿 異戊醇 磷酸鹽緩沖溶液 SNET TE
Sorvall 離心機(jī)及 H1000B、SH-3000 轉(zhuǎn)頭 聚丙烯管 振蕩平臺(tái) 振蕩平臺(tái)或振動(dòng)孵箱 Shepherd 氏鉤

步驟

一、材料

1. 緩沖液及溶液

乙醇

異丙醇

酚：氯仿：異戊醇（25:24:1 V/V)

磷酸鹽緩沖溶液

SNET（20 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0)，5 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，400 mmol/L NaCl，1% (m/V) SDS）

TE ( pH 8.0)

2. 酶及緩沖液

蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

Sorvall 離心機(jī)及 H1000B、SH-3000 轉(zhuǎn)頭（或其他相當(dāng)?shù)脑O(shè)備)

3. 專用設(shè)備

聚丙烯管（17 X 100 mm)

室溫及 4℃ 振蕩平臺(tái)

預(yù)設(shè)為 55℃ 的振蕩平臺(tái)或振動(dòng)孵箱

Shepherd 氏鉤

4. 細(xì)胞和組織

培養(yǎng)的細(xì)胞

鼠尾或小鼠組織

二、方法

1. 準(zhǔn)備適量的裂解緩沖液，即在 SNET 中加入蛋白酶 K 使終濃度為 400 μg/ml 向鼠尾或其他組織中加入裂解緩沖液。

2. 管子垂直放置于振蕩平臺(tái)或振動(dòng)恒溫箱中 55℃ 放置過夜。

消化過程中樣品的充分混合是非常重要的。過夜消化后，應(yīng)當(dāng)看不到組織或鼠尾，緩沖液呈灰色乳狀液。

3. 加入等體積的酚: 氯仿: 異戊醇，密閉管口，室溫下置于振蕩平臺(tái) 30 min。

4. 離心分離有機(jī)相和水相。17X100 mm 的 Falcon 聚丙烯管中的樣品室溫下 666 g 離心 5 min, 即帶有旋轉(zhuǎn)桶的 Sorvall H1000B 轉(zhuǎn)頭 1800 r/min 或 Sorvall SH3000 旋轉(zhuǎn)桶 1600 r/min。對于較小體積的樣品，樣品置于微量離心管中室溫下用最大轉(zhuǎn)速離心 5 min。轉(zhuǎn)移上層水相至一新的 Falcon 管或微量離心管中。

5. 加入等體積的異丙醇沉淀 DNA。4℃，13250 g 離心（8000 r/min，Sorvall 3000 轉(zhuǎn)頭或微量離心管中用最大轉(zhuǎn)速）15 min 收集沉淀的 DNA。

6. 小心除去異丙醇。將 DNA 沉淀浸于 1 ml 70% 的乙醇里。如果沉淀較松散，再離心 5 min。除去 70% 的乙醇，室溫下空氣中干燥沉淀約 15~20 min。

不要讓 DNA 沉淀*干操，否則極難溶解。

7. 加入 0.5 ml TE, 4℃ 下輕柔振蕩過夜使核酸沉淀溶解。

8. 將溶液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，室溫保存。

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